Isku hagaajin kasta oo ka mid ah qaybaha ficil celinta Polymerase Chest Reaction (PCR) waxay bedeli kartaa tayada natiijada, ama hagaajinta ama yaraynaysa wax soo saarka iyo tayada ama hagaajinta qeexitaanka iyo jawaab-celinta. Qodobbada saameeya natiijada kama dambaysta ah waxay noqon kartaa mid jidheed (ie, heerkulka, waqtiyada wareegga ah) ama kiimikada (ie, diiradda template, nooca enzim loo isticmaalo). Kuwa soo socda ayaa ah dhowr arrimood oo muhiim ah oo saameeya guusha PCR.
01 Xaaladaha Nadiifinta Nadiifka ah
Maadaama PCR uu awood u leeyahay inuu ogaado hal unug oo DNA ah, waa muhiim in la ilaaliyo shuruudaha sharafta ee shaybaarka. Had iyo jeer xiro galoofyada cusub, isticmaal muraayada qalabka nadiifka ah, tuubooyinka iyo talooyin tube iyo xalal nadiif ah, oo nadiifi aagga shaqada ka hor inta aanad shaqada bilaabin.
Had iyo jeer ku dar falcelinta kontoroolka, iyada oo aan lahayn DNA template iyo iyada oo aan lahayn enzym, si loo hubiyo natiijooyinka dhab ahaantii ay ugu wacan tahay kordhinta sambalka saxda ah.
Dadka intooda badan waxay hubiyaan inay haystaan xalal u gaar ah oo aan la wadaagin si ay u sameeyaan xalinta dhibaatooyinka fudud iyo dhuumaha loo yaqaan "pipetes" loogu talagalay inay badanaa u dhigaan PCR oo kaliya. DNase iyo tubooyinka PCR-ga ee bilaa lacag la'aanta ah, talooyin tube-u-adkeysi leh oo farsamo ah iyo ka shaqeynta furaha foorarka leh nalka UV sidoo kale waa siyaabo lagu yareeyo dhibaatooyinka.
02 Qaybaha Kiimikada
- Hayso 18 ilaa 24 xariiq
- Ma laha qaab labaad (sida, wareegyada timaha)
- Qaybin isku dheelitir oo ah isu-qeybinta G / C iyo A / T
- Ma ahan mid udhexeeya midba midka kale 3da cagta
- Heer kulul (Tm) qiyaastii 5 ilaa 10 digrii Celcius ka hooseeya heerkulka qaboojinta, taas oo badanaa inta u dhexeysa 55 iyo 65 darajo Celcius
Tm labadaba labadaba waa in ay la mid noqdaan natiijooyinka ugu fiican.
03 Isku-darka Is-beddelka: Template iyo Primers
Isku-darka caadiga ah ee astaamaha ah waa inta u dhexeysa 0.1 iyo 0.6 micromoles / L. Qadarka mawduuca waa kala duwan yahay iyadoo ku xiran nooca DNA (bini-aadan, bacterial, plasmid).
Iyadoo la eegayo qadar yar oo qaab-dhismeed ah, waxaa jira xeelado kale oo lagu hagaajinayo natiijooyinka, sida tirada tirooyinka korodhka ah ama isticmaalka "bilawga kulul." Had iyo jeer tijaabi asaasiyaal cusub oo leh falcelin xakameyn ah, si aad u hubiso in ay ka shaqeeyaan xaaladaha tijaabada ah ee gaarka ah.
04 Isku Diiwaangelinta: Hawsha Enzyme
Fiirinta MgCl2 ee isku dhafanaanta fal-celinta waxay saameyn ku yeelan kartaa natiijada PCR waxayna ka ciyaari kartaa kaalin muhiim ah oo ku jirta falcelin dheeri ah. Magnesium cation waxay qaabab badan oo lagu xalliyo dNTPs si ay u soo saaraan substrate dhabta ah in enzyme polymerase ay u aqoonsato.
Tirada guud ee dhammaan afarta dNTPs ayaa sidoo kale caawiya hoos u dhigista heerka qaladka ee polymerase. Waxyaabaha kale ee wax lagu daro sida betain, BSA, saabuun, DMSO, glycerol, iyo pyrophosphatase waxay sidoo kale saameyn kartaa xayndaabka enzim ama waxtarka jawaab celinta.
05 Nooca Thermocycler
Markaad soo iibsato qalabka sheybaarka, maskaxda ku hay in qaar ka mid ah kululeeyayaasha ay ka yaryihiin kuwa kale si ay u joogteeyaan heerkulka saxda ah ee la doonayo.
Tani waa hal meel oo raqiis ah oo aan la bixin doonin muddada dheer marka aad la kulanto fal-celin culus ama isticmaalka asaasiga ah ee u baahan qiyaas aad u yar oo heerkulbeeg ah.
Tubbooyinka fal-celin-celinta ee loogu talagalay in loogu talagalay inay ku habboonaato nooca saxda ah ee thermocycler ee aad isticmaasho, ayaa sidoo kale gacan ka geysaneysa sidii loo hagaajin lahaa heerkulka xasaasiyadda.
06 Cycle Settings
Wax-soo-saarka kordhinta ayaa la gaari karaa iyada oo la kordhinayo waqtiga kordhinta ee ku saabsan 20-kii wareeg ee kasta, si loo magcaabo enzymada yar si loo kordhiyo shey kale. Badanaa, in ka yar 40 wareeg oo ku filan in lagu kordhiyo in ka yar 10 molecules template si xoog leh ku filan si aad u eegto a geliyo etidium bromide agarose .